本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用【yòng】于体外【wài】定量检测血清、血【xuè】浆、组织匀浆及【jí】相关【guān】液体样本中牛牙骨质蛋白【bái】1(CEMP1)的含量【liàng】。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓【nóng】度【dù】依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常标本检验，标【biāo】本的正常浓度值均在试【shì】剂盒提【tí】供的【de】检测【cè】范【fàn】围内，实验过程中直接【jiē】取50μL样本上样【yàng】即可。当有部分样本值【zhí】超过最【zuì】大标准品浓【nóng】度时，可用【yòng】样本稀【xī】释【shì】液将标本进行适当稀释后再进行实【shí】验。

牛牙骨质蛋白1(CEMP1)试剂盒检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰【bīng】箱【xiāng】中取出的【de】浓【nóng】缩洗涤液可能有【yǒu】结晶，属于正常现象；放【fàng】置【zhì】室温，轻【qīng】摇均匀，待结晶溶解后再【zài】配置洗涤液。可将20ml浓缩洗【xǐ】涤液用蒸馏水或去离【lí】子水稀释配【pèi】置成400ml工作浓度【dù】的洗涤【dí】液，未用完的放【fàng】回4℃

3.20×洗涤缓【huǎn】冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀【xī】释【shì】，即1份【fèn】20×洗涤缓【huǎn】冲液加19份蒸馏【liú】水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹【jiá】心法酶联免疫【yì】吸附试验（ELISA）。往预先【xiān】包被牛牙骨【gǔ】质蛋白1(CEMP1)捕获抗体的包被微【wēi】孔中【zhōng】，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温【wēn】育并【bìng】洗涤。用底物【wù】TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下【xià】转化成蓝色，并在【zài】酸【suān】的作用下转化成【chéng】最终【zhōng】的【de】黄色。颜【yán】色的深浅和样品中【zhōng】的牛牙骨【gǔ】质蛋白1(CEMP1)呈【chéng】正相关。用酶标仪在450nm 波【bō】长下测定【dìng】吸光【guāng】度【dù】（OD 值），计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及【jí】枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血【xuè】清：将收集【jí】于血清分离【lí】管的【de】全血标【biāo】本在室温放置2小时或4℃过夜【yè】，然后1000×g离【lí】心20 分钟，取【qǔ】上清【qīng】即可，或将上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或【huò】肝【gān】素【sù】作为抗凝剂采集标本，并将标本在采【cǎi】集后【hòu】的30分钟内【nèi】于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取【qǔ】上清即【jí】可检测，或将上【shàng】清【qīng】置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用【yòng】预【yù】冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残【cán】留血【xuè】液（匀浆中裂解【jiě】的红【hóng】细胞会影响测量结果），称重【chóng】后将组织剪【jiǎn】碎【suì】。将【jiāng】剪碎的组织与对应体积【jī】的PBS（一般【bān】按1:9的重量【liàng】体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体【tǐ】体【tǐ】积可根据实验需要适当调整，并做【zuò】好记【jì】录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻【bō】璃匀浆器【qì】中【zhōng】，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细【xì】胞，可【kě】以【yǐ】对【duì】匀浆液进行超【chāo】声破碎，或反复冻融。最后将匀【yún】浆【jiāng】液于5000×g离心5~10分钟，取【qǔ】上清检测。

4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟【zhōng】，取上清即可检【jiǎn】测，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应【yīng】避免反复【fù】冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品收集后若在1周内进行【háng】检测的【de】可【kě】保【bǎo】存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻【dòng】存【cún】于-20℃（1个月内检【jiǎn】测【cè】），或-80℃（6个月内检测【cè】），避免反复冻融，标本溶血会【huì】影响最【zuì】后检【jiǎn】测结【jié】果，因【yīn】此溶血【xuè】标本不宜进行此项检【jiǎn】测。

注意事项：

1.严格按照规定的时【shí】间和【hé】温度进行温育以保证准【zhǔn】确结果。所有试剂都必【bì】须在【zài】使用前达到【dào】室温9-21℃。使【shǐ】用后【hòu】立【lì】即冷藏保存试剂。

2.洗板不【bú】正确可以导致不准确【què】的结果。在加入底【dǐ】物前确保尽量【liàng】吸【xī】干【gàn】孔【kǒng】内【nèi】液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色液应呈无【wú】色或很浅的颜色，已经【jīng】变【biàn】蓝的底物液不能使【shǐ】用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反【fǎn】应试【shì】剂【jì】不能接触漂白溶剂或漂白【bái】溶剂所【suǒ】散发【fā】的强【qiáng】烈气体。任何漂白成分都会破坏试【shì】剂盒中反应【yīng】试【shì】剂的生物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能【néng】传播疾病，所有的样品【pǐn】都应【yīng】管理好，按照规定【dìng】的程序【xù】处【chù】理样品和检测装置【zhì】。

操作步骤：

1．从室【shì】温平衡【héng】60min后的铝箔袋中取【qǔ】出所需板条，剩余板条【tiáo】用自封【fēng】袋密封【fēng】放【fàng】回4℃。

2．设置标准【zhǔn】品孔和样本孔，标准【zhǔn】品孔各加【jiā】不同浓度的标【biāo】准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白【bái】孔外，标准品【pǐn】孔和【hé】样本孔【kǒng】中【zhōng】每孔【kǒng】加入辣根过氧化物【wù】酶（HRP）标记的检测【cè】抗体100μL，用封板膜封住反应孔【kǒng】，37℃水浴锅或恒温箱温育【yù】60min。

5．弃去【qù】液体【tǐ】，吸水纸上【shàng】拍干【gàn】，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此【cǐ】重复【fù】洗【xǐ】板【bǎn】5次（也可用洗【xǐ】板机【jī】洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加入终止【zhǐ】液50μL，15min内，在450nm波【bō】长处测定【dìng】各孔的OD值。

牛牙骨质蛋白1(CEMP1)试剂盒实验结果计算：

绘制标准【zhǔn】曲线：在Excel工【gōng】作表【biǎo】中，以标准品【pǐn】浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出【chū】标准品【pǐn】线性【xìng】回归曲线，按曲线【xiàn】方程计算各样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重【chóng】复性：板【bǎn】内变【biàn】异系数小于10% ，板间【jiān】变异系数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避【bì】免交叉感染，配置不同浓【nóng】度标准品、上样、加【jiā】不同试剂都需【xū】要更换枪头。另外不【bú】同【tóng】试剂请【qǐng】分别使用不同【tóng】的移【yí】液【yè】槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的显色底物在上【shàng】板前【qián】应为无色，请避【bì】光【guāng】保存；假如微【wēi】孔板后【hòu】，将【jiāng】由物色变成不同深度的蓝色【sè】。

5.终止液上板【bǎn】顺序应同【tóng】显色【sè】底【dǐ】物上板顺序一致；加【jiā】入终止液后，孔内颜色由蓝变黄；若【ruò】孔内【nèi】有绿色，则表明孔内液【yè】体未【wèi】混匀；请充【chōng】分混合。

说明：

1.由于现有条【tiáo】件及科学技术水平尚【shàng】不能【néng】对所有供货商【shāng】提供的【de】所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品【pǐn】可能【néng】存在一定的【de】质量技术【shù】风险【xiǎn】。

2.最终的【de】实【shí】验结果与试剂的有【yǒu】效性、实验者的相【xiàng】关操作以及【jí】当时的【de】实验环境密切相关【guān】，请务必准备充足【zú】的【de】标本备份【fèn】。

3.不同批【pī】次的同一产品可能会有【yǒu】少许差【chà】别，如：检测限、灵【líng】敏度以及显色时【shí】间等【děng】，请依据试剂盒内说明书进【jìn】行【háng】实验【yàn】操作，网站电子【zǐ】版说明书仅作参考。

4.只有全部使【shǐ】用本【běn】试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混【hún】用其他制造商【shāng】的产品。只有严【yán】格遵【zūn】守本试剂盒的实验说明【míng】才会得【dé】到最【zuì】佳的【de】检测结果。