MOC1细胞系

MOC1细胞系

T150烧瓶 : 07-200-64

T75烧瓶 : 10-126-37

冷 冻 剂 : 03-374-059

45um过滤器 : 09-754-21

05% : sh30236.01

25% : sh30042.01

惰性谱线 : MOC1,22

侵略性线 : MOC2

IMDM : sh30228.02 Hams

营养混合物 : F10-F12sh30026.01胎牛血清，特征-海克隆

目录 / 批【pī】次号【hào】 :  sh30071.03 / AWK24001

过【guò】滤1L过滤器瓶的【de】过滤器【qì】 :  09-761-108

科学试剂【jì】目【mù】录编号 :  胰岛素：I6634-50mgH0135-1mg   

EMD微孔试剂目【mù】录编号 :  表皮生【shēng】长因子【zǐ】(EGF)，重组人：01-107

细胞系特征

1. 惰性- MOC1：基于体内研【yán】究的侵袭【xí】性较低【dī】。如【rú】果从80%合【hé】流T150通过1：12，需要9-20天才能达【dá】到80%合 流。与更具【jù】侵【qīn】袭性的细胞系相比，MOC1细胞系：在收获时需要的时间更长。

2. 侵袭性- MOC2：基【jī】于体内研【yán】究，更具侵袭性。如果【guǒ】从80%合流T150通过1：12，需【xū】要9-20天才能【néng】达到 80%合流。与惰性细胞系相比【bǐ】，惰性细【xì】胞系更容易从烧瓶中分【fèn】离出【chū】来【lái】。

从T150收集和传递细胞/80%融合

1. 将T150中的介质倒入倾倒瓶中

2. 用10-20ml PBS清洗一次。倒出PBS清洗液。

3. 加入1.5ml 0.05%覆盖整个表面积，从而接触所【suǒ】有细胞(这样做，使细胞不【bú】会暴【bào】露【lù】在)，，然后再应用【yòng】1。

4. 放置【zhì】在37C培【péi】养箱中。侵袭性细胞【bāo】系孵【fū】育9-20分钟【zhōng】，惰性反【fǎn】应可达9-20 min，但在9-20 min后 检查。

5. 故意敲击烧瓶一侧的手掌几次，使细胞松动。

6. 在显微镜下检查【chá】，看【kàn】细胞在培【péi】养基中是否能自由漂浮。如【rú】果【guǒ】大多数没有，请放回37C培养箱中 再放置9-20分钟。尽量【liàng】不要让【ràng】细胞【bāo】留，因【yīn】为这样会杀死细胞【bāo】。

7. 一旦所有或大部分细胞漂【piāo】浮，加入10ml IMDM MOC线【xiàn】培养基来中和【hé】反【fǎn】应。

8. 移液管培养基【jī】和细【xì】胞从烧瓶【píng】中进入15ml的【de】锥形细胞到颗粒细胞。离心机【jī】，1000 RPM x 5 min。

9. 倒出上清液。

10. 以1：12的速度通过细【xì】胞-在另外12毫【háo】升的培【péi】养基【jī】中重悬细胞。

11. 从其中取出1ml，放入新的T150烧【shāo】瓶【píng】中，总【zǒng】体【tǐ】积为【wéi】22ml的IMDM MOC系【xì】培养基(稀释1：12）

1２. 放回37C的培养箱中生长【zhǎng】。应【yīng】在【zài】9-20天内达到【dào】80%的【de】合流率。

冷冻细胞系

1. 从T150中收集细胞，如下图所示

2. 在15ml锥形管中旋转成颗粒(1000 RPM x5分钟）

3. 排出上清液

4. 点击15ml圆锥形管，重悬细胞

5. 加入1.5ml IMDM MOC系培养【yǎng】基，在培养【yǎng】基中【zhōng】重建细胞【bāo】-保持【chí】冰上

6. 管入冰时缓慢加入1.5 ml冷冻介质(在IMDM MOC线介质中制作冷冻介质-20%DMSO。例：20ml库存-加【jiā】入【rù】16ml IMDM MOC线培养 基和4ml DMSO。注射器过滤器【qì】，使用【yòng】um过滤【lǜ】器

7. 每份1毫升到3个冷冻瓶

8. 在-80摄氏度内储存不超过2周

9. 在9-20周内放入液氮溶液中

注：如果需【xū】要，可增加到2ml IMDM和2ml冷冻培养【yǎng】基，以储【chǔ】存在4个小瓶中。此外，在冷冻细胞 前计数细【xì】胞并记录在小【xiǎo】瓶上【shàng】。

解冻细胞系

1. 在解冻【dòng】前，将21ml IMDM MOC线培养基加入到T150中【zhōng】(如【rú】果【guǒ】想解冻成【chéng】T75，则将10ml加入到T75 中【zhōng】）

2. 将液氮从冷冻瓶中取出，喷上含有70%酒精的小瓶进行清洗。

3. 将冷【lěng】冻瓶的下半部分放在37摄【shè】氏度的【de】水【shuǐ】浴【yù】中(不让盖子【zǐ】接触水【shuǐ】，以避免污染），直到【dào】 有一【yī】小块冰漂浮着。

4. 再次用ETOH喷洒冷冻瓶，然后放在【zài】引擎【qíng】盖【gài】上。将1ml培养液【yè】移液管【guǎn】加入到1ml细胞【bāo】中，并将这 些2ml加入【rù】到已【yǐ】经含有培养基的T150中(使一个T150总共【gòng】有22ml)。

5. 在【zài】T150烧瓶中取一些培养基，冲洗【xǐ】冷【lěng】冻瓶，然后【hòu】平板放置，以确保所【suǒ】有残留的细胞【bāo】都【dōu】留在冷 冻瓶【píng】中【zhōng】。

注入小鼠侧腹（异位）所需细胞浓度：

MOC1：MOC22：(用0.15ml注射【shè】1e6细胞【bāo】）=6.66e6细胞/ml

MOC2：(用0.15ml注射1e5细胞)=6.66e5细胞/ml

1. 用0获取细胞。如上所述。

2. 用【yòng】IMDM MOC系培养基【jī】，将细胞旋【xuán】转成50ml锥形【xíng】的颗粒(1000 RPM x5分【fèn】钟)。 注：使【shǐ】用50ml锥【zhuī】形，允许小尺寸针抽出细胞供注射。

3. 再【zài】次将细胞旋转【zhuǎn】成小颗【kē】粒。倒出PBS上清液(不)。在计算【suàn】体积的【de】冰PBS中重悬颗粒以【yǐ】达到 适当的【de】浓度，记住【zhù】灌【guàn】注上【shàng】清后50ml锥形中还有【yǒu】 200ul。

4. 将50ml锥形冰转移【yí】，每只小鼠皮【pí】下注【zhù】射0.15ml(150ul)细胞。

5. 按照标准协议注入鼠标【biāo】。我们用【yòng】1毫升注射器。我们用1.5英寸21号针【zhēn】绘制【zhì】细胞，并将针【zhēn】切【qiē】换 到?英寸26号针【zhēn】进行注射。

6. 用【yòng】10ml冰水【shuǐ】PBS重悬细胞颗粒(确保尽可能【néng】多【duō】地去除含【hán】有FCS的介质)，再次将细【xì】胞旋【xuán】转成颗【kē】 粒(1000 RPM x5分钟)

7. 用9-20 ml冰PBS重悬【xuán】细胞颗粒再次清洗【xǐ】细胞(体积【jī】取决于颗粒的大【dà】小，因【yīn】为【wéi】你将使用【yòng】这【zhè】个体积 来计数细【xì】胞）

8. 使【shǐ】用血细胞【bāo】计数仪或自【zì】动【dòng】细胞计数器计数每【měi】毫升的细胞，使用【yòng】台盼蓝来消【xiāo】除死亡细胞。使用 存【cún】在【zài】的【de】细胞总数(细胞/mlx总PBS的mlPBS)，计算重悬细【xì】胞颗粒所需的【de】体积【jī】，以达到6.66e6(MOC1，MOC22)或6. 66e5 cell/ml(MOC2)浓度。

例如：MOC1的【de】细胞计数为： 2.8e6细胞【bāo】/mlx5ml(PBS)=14e6细胞总【zǒng】数。14e6细胞/ 6.66e6细胞/ml=2.1mlPBS将【jiāng】细胞【bāo】颗粒悬浮【fú】在其中。

1L媒体协议

将培养基为2：1 IMDM制成营养混合物

1. 解冻胎牛血清和宾州/链球菌在37摄氏度

2. 1L过滤瓶加入626ml IMDM和313ml营养混合物

3. 添加50毫升FCS

4. 添加10ml Penn流

5. 过滤器

6. 加入1ml5mg/ml胰岛素(或500ul，10mg/ml)

注：用10ml无【wú】菌H20稀【xī】释胰岛【dǎo】素50mg粉末，加50ul无菌1N盐【yán】酸【suān】，4C箔保存

7. 加入40ug

注：8. 添加5ug EGF

注：使EGF - make 1ug/ul原液【yè】用无血清IMDM稀释，每升加入【rù】5ul。在-80处存储【chǔ】等【děng】分。