本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本【běn】试剂盒用于体外定量检测血清【qīng】、血浆、组织匀【yún】浆及【jí】相关液体样本中大鼠组【zǔ】织因子【zǐ】(TF)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过大量正常标【biāo】本检验，标本的正【zhèng】常浓度【dù】值均【jun1】在试剂盒提供的检测范围内，实【shí】验【yàn】过程中直【zhí】接取50μL样本上样即可【kě】。当有部分样本【běn】值超【chāo】过标准品浓【nóng】度时【shí】，可用样本稀释液将标本【běn】进行适当稀释后再进行【háng】实【shí】验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱中取出的浓缩洗【xǐ】涤液【yè】可能有【yǒu】结【jié】晶，属于正常现象【xiàng】；放置室温，轻摇均匀，待结晶溶【róng】解【jiě】后再配置【zhì】洗涤液。可将【jiāng】20ml浓缩【suō】洗涤【dí】液用蒸【zhēng】馏水或去离子水【shuǐ】稀释配置成【chéng】400ml工作浓度的洗涤液【yè】，未【wèi】用完的放回4℃

3. 20×洗涤缓冲液【yè】的【de】稀释：蒸馏水【shuǐ】按1：20稀【xī】释【shì】，即1份20×洗涤缓【huǎn】冲液加19份【fèn】蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包【bāo】被大【dà】鼠组织因子(TF)捕获抗体的【de】包被微【wēi】孔【kǒng】中，依【yī】次加入标本、标准品【pǐn】、HRP标记的检【jiǎn】测抗体，经过温【wēn】育并洗涤。用底物TMB显【xiǎn】色【sè】，TMB在过氧化物酶的催化【huà】下转化成【chéng】蓝色，并在【zài】酸的作用下转化成黄【huáng】色。颜色【sè】的深浅和【hé】样品【pǐn】中的大鼠组织因子(TF)呈正相关。用【yòng】酶标仪在【zài】450nm 波长下测定【dìng】吸光度【dù】（OD 值），计【jì】算【suàn】样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小【xiǎo】时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟【zhōng】，取上清即可【kě】，或【huò】将【jiāng】上【shàng】清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但应避免【miǎn】反【fǎn】复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为【wéi】抗凝剂【jì】采集标【biāo】本，并将标本在采集后的30分【fèn】钟【zhōng】内于9-21℃ 1000×g离心15分钟【zhōng】，取上清【qīng】即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应【yīng】避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗【xǐ】组织，去除【chú】残留血液（匀浆中裂解的红【hóng】细胞【bāo】会影响【xiǎng】测量结果），称重后将【jiāng】组织【zhī】剪【jiǎn】碎。将剪碎的【de】组织与对应体积【jī】的【de】PBS（一【yī】般按【àn】1:9的【de】重量体【tǐ】积比，比如1g的组织样品对【duì】应9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实【shí】验【yàn】需【xū】要适当调【diào】整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎【suì】，或反复冻融。将匀【yún】浆【jiāng】液于5000×g离心5~10分钟【zhōng】，取上清【qīng】检【jiǎn】测【cè】。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟【zhōng】，取上清【qīng】即可【kě】检测，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存【cún】，但应避【bì】免【miǎn】反复冻【dòng】融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的【de】可【kě】保【bǎo】存于4℃，若不能及时检【jiǎn】测，请【qǐng】按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内【nèi】检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶【róng】血会影【yǐng】响检【jiǎn】测结果，因【yīn】此溶血标本不宜进行此【cǐ】项检测。

注意事项：

1. 严【yán】格按照【zhào】规定的时【shí】间和【hé】温【wēn】度进行温育以保证准确结果【guǒ】。所有试剂都必须在使【shǐ】用前【qián】达到室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确【què】可以【yǐ】导致不准确的结【jié】果。在加入底物前确保【bǎo】尽量吸干【gàn】孔【kǒng】内液体。温育过程中不要让微孔【kǒng】干【gàn】燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不【bú】能接触漂白溶剂【jì】或漂【piāo】白溶剂所散发的强烈【liè】气体【tǐ】。任何【hé】漂白成分【fèn】都会破坏试剂【jì】盒中【zhōng】反应试剂的生物活性【xìng】。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播【bō】疾【jí】病，所有的样品【pǐn】都应【yīng】管理【lǐ】好，按照规定的程序【xù】处理样品和检测装置【zhì】。

操作步骤：

1．从室【shì】温平衡60min后的铝【lǚ】箔袋中取出所需板条，剩余板条【tiáo】用【yòng】自【zì】封袋密封放回4℃。

2．设【shè】置标准品孔和【hé】样本孔，标准品孔各加不同浓度的【de】标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白【bái】孔【kǒng】外，标准品【pǐn】孔和样【yàng】本孔中每孔加入辣根过【guò】氧化物【wù】酶（HRP）标记的检测抗【kàng】体【tǐ】100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒【héng】温【wēn】箱温【wēn】育60min。

5．弃【qì】去液体，吸【xī】水【shuǐ】纸上拍干，每【měi】孔加满洗涤液（350μL），静【jìng】置1min，甩去【qù】洗涤液，吸水【shuǐ】纸上拍干【gàn】，如此重复洗板5次【cì】（也可【kě】用洗板机【jī】洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔加【jiā】入终【zhōng】止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔【kǒng】的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表【biǎo】中，以标准品浓度作横【héng】坐标，对应【yīng】OD值作【zuò】纵坐标，绘制出标准品线【xiàn】性回【huí】归曲线，按曲线方程【chéng】计算各样本浓【nóng】度值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交叉感染【rǎn】，配置不同浓度标准品、上样【yàng】、加不同试剂【jì】都需要更换【huàn】枪头【tóu】。另外不同试剂【jì】请【qǐng】分【fèn】别使用不同的移液槽【cáo】。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的显色底物在【zài】上【shàng】板前应为无色，请避光保存；假【jiǎ】如微【wēi】孔板后【hòu】，将由物色变【biàn】成不同【tóng】深度的蓝色。

5. 终止液上板【bǎn】顺序应同显【xiǎn】色【sè】底物上板顺序一致；加入终【zhōng】止液【yè】后，孔内颜【yán】色由蓝变【biàn】黄；若孔内有绿色，则表明孔内【nèi】液体未【wèi】混匀；请充分混合。

说明：

1. 由于现有条件及科学技术水平尚不能【néng】对所有供货商提供的所有原料【liào】进行全【quán】面的【de】鉴定【dìng】与分【fèn】析【xī】，本产品【pǐn】可能【néng】存在一定的【de】质量技术风险【xiǎn】。

2. 最终【zhōng】的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操【cāo】作以及当时【shí】的实验环【huán】境【jìng】密切【qiē】相关，请务必准备【bèi】充足的【de】标本备份。

3. 不同批次的同一产品可【kě】能会有少许差别，如：检测【cè】限、灵敏度以及显色时间【jiān】等【děng】，请依据试【shì】剂盒内说【shuō】明书【shū】进行【háng】实验操【cāo】作，网【wǎng】站电子【zǐ】版说明书仅作参考。

4. 只有【yǒu】全部使用本试剂盒配套试剂才能保【bǎo】证检测【cè】效果，不【bú】能混【hún】用其他制造商的产【chǎn】品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才【cái】会【huì】得【dé】到最佳的【de】检测【cè】结果。