本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于【yú】体外定量检测血清【qīng】、血浆【jiāng】、组织匀浆及【jí】相【xiàng】关液【yè】体样本中大鼠组织金属蛋白【bái】酶抑制【zhì】因子3(TIMP-3)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常【cháng】标本【běn】检验，标本的【de】正常浓度值均在试剂盒【hé】提供的【de】检测范围【wéi】内，实验过程中【zhōng】直接取50μL样本上样即可【kě】。当【dāng】有部分样本【běn】值超过标准品浓度时，可用【yòng】样【yàng】本【běn】稀释【shì】液【yè】将标本进行适当稀释后【hòu】再进行实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰【bīng】箱中取出的【de】浓缩洗涤【dí】液可能有结【jié】晶，属【shǔ】于正常【cháng】现【xiàn】象；放置【zhì】室温，轻摇均匀，待结溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤【dí】液用【yòng】蒸【zhēng】馏水或去离子水稀释配置成【chéng】400ml工作浓【nóng】度的洗涤液【yè】，未用完【wán】的放回4℃

3. 20×洗【xǐ】涤缓冲液【yè】的稀【xī】释：蒸馏水按1：20稀【xī】释，即1份20×洗涤缓冲液加19份【fèn】蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大【dà】鼠组织金【jīn】属蛋白酶【méi】抑制因子3(TIMP-3)捕获抗体的【de】包被微孔中，依次【cì】加入标本、标准【zhǔn】品、HRP标【biāo】记的【de】检测抗体【tǐ】，经过温育洗涤【dí】。用底【dǐ】物TMB显【xiǎn】色，TMB在过氧【yǎng】化物酶的催【cuī】化【huà】下【xià】转化成蓝色【sè】，并【bìng】在酸的作【zuò】用【yòng】下转化成黄色。颜色的深浅和样【yàng】品中的大鼠【shǔ】组织金属【shǔ】蛋白酶抑制因子3(TIMP-3)呈正相关。用酶【méi】标仪【yí】在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计【jì】算样【yàng】品【pǐn】浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或【huò】4℃过夜【yè】，然后1000×g离心20 分钟，取上清【qīng】即可，或将【jiāng】上【shàng】清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复【fù】冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作【zuò】为【wéi】抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内【nèi】于【yú】9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清【qīng】置于-20℃或【huò】-80℃保存【cún】，但【dàn】应避【bì】免反复冻【dòng】融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗【xǐ】组织，去除残留血液（匀浆【jiāng】中【zhōng】裂解【jiě】的红细【xì】胞会影响测量结果），称重【chóng】后【hòu】将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体【tǐ】积比【bǐ】，比如1g的组织样【yàng】品对应【yīng】9mL的【de】PBS，具体体积可【kě】根据实验需要适当调整，并【bìng】做好记录。推荐在【zài】PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀【yún】浆器中，于冰【bīng】上充分研【yán】磨。为了进一步【bù】裂解组织细【xì】胞，可【kě】以对匀【yún】浆液进行超声破碎，或反复【fù】冻融。将匀浆液【yè】于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心【xīn】20分钟，取上清即可检测，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存【cún】，但应避免【miǎn】反【fǎn】复冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若【ruò】不能及【jí】时检测，请按【àn】一次【cì】使用量分装，冻存于-20℃（1个【gè】月内检测），或【huò】-80℃（6个【gè】月内检测），避免反复冻【dòng】融，标本溶血【xuè】会影响检测结果，因此【cǐ】溶【róng】血标本不宜【yí】进行此项检测。

注意事项：

1. 严格按照【zhào】规定的时【shí】间和【hé】温度进【jìn】行【háng】温育以保证准确结果。所有试剂都必【bì】须在使用【yòng】前达【dá】到室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准【zhǔn】确的结【jié】果。在加入【rù】底物前确保尽量吸干【gàn】孔【kǒng】内液体。温育过【guò】程中不要【yào】让【ràng】微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任【rèn】何反应【yīng】试剂【jì】不能接触漂白溶剂或【huò】漂白溶【róng】剂所散发的强烈【liè】气体【tǐ】。任何漂白成【chéng】分都会破坏试【shì】剂盒【hé】中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病【bìng】，所有【yǒu】的样品都【dōu】应管理好，按照规定的程【chéng】序【xù】处【chù】理样品和检测装置。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔【bó】袋中取出所需【xū】板条，剩余板【bǎn】条用自【zì】封袋密封【fēng】放回4℃。

2．设置【zhì】标准【zhǔn】品孔和样本孔，标准品孔各加不同【tóng】浓【nóng】度的【de】标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准品孔和【hé】样本孔中每孔加入辣根过氧化物【wù】酶（HRP）标【biāo】记的【de】检测抗体【tǐ】100μL，用封板膜【mó】封住反应孔，37℃水浴【yù】锅【guō】或恒温箱【xiāng】温育60min。

5．弃去液体【tǐ】，吸水【shuǐ】纸【zhǐ】上拍干，每孔【kǒng】加满洗【xǐ】涤液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗涤液【yè】，吸水【shuǐ】纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加【jiā】入终【zhōng】止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔【kǒng】的OD值【zhí】。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作【zuò】表中，以标准【zhǔn】品浓度作横【héng】坐标，对【duì】应OD值作纵坐标，绘制出标【biāo】准【zhǔn】品线性回归曲线，按曲线【xiàn】方程【chéng】计算各样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为【wéi】了避【bì】免交【jiāo】叉感【gǎn】染，配【pèi】置不同浓度标准品、上样、加不同试剂都需要【yào】更换枪头。另外不同【tóng】试剂【jì】请分别使用不同【tóng】的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合【hé】后的【de】显色底物【wù】在【zài】上【shàng】板前应【yīng】为无色，请避光保存；假如微孔板后，将由物色变成不【bú】同深度的【de】蓝色。

5. 终止液上板顺序应同显【xiǎn】色底物上板顺序【xù】一致；加入终【zhōng】止液后【hòu】，孔内【nèi】颜【yán】色由蓝变黄；若孔内有绿色，则表明【míng】孔【kǒng】内液体未混匀；请充【chōng】分混【hún】合【hé】。

说明：

1. 由于现有条件及【jí】科学技术水平尚不能对【duì】所有供货商提供的所有【yǒu】原料进行全面【miàn】的【de】鉴【jiàn】定【dìng】与【yǔ】分析，本产品可【kě】能【néng】存在一定的质量技术风险。

2. 实验【yàn】结果与试剂的【de】有效性、实验者【zhě】的相关操作以及【jí】当时的【de】实验【yàn】环境密切相【xiàng】关，请务必准备充足的标本备份。

3. 不同批次的同一产【chǎn】品可能会有少许差【chà】别，如：检测限、灵敏度以【yǐ】及显色时间等，请依据试剂盒内【nèi】说明书【shū】进行实验操【cāo】作，网【wǎng】站电子【zǐ】版【bǎn】说明书仅作参【cān】考【kǎo】。

4. 只有全部【bù】使用本试剂盒配套试剂才【cái】能保证检测效果，不【bú】能混【hún】用其【qí】他制造【zào】商的产品。只【zhī】有严格遵守本试剂盒的实验说明【míng】才会得到检【jiǎn】测结果。