本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于体【tǐ】外定量【liàng】检测血【xuè】清【qīng】、血浆【jiāng】、组织匀浆及相【xiàng】关液体样本【běn】中大鼠组织金属【shǔ】蛋白酶抑制因子2(TIMP-2) 的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常标本检【jiǎn】验，标本【běn】的正常浓度值【zhí】均【jun1】在试【shì】剂【jì】盒提供的检测范围内，实验【yàn】过程中直接【jiē】取50μL样本上样即可。当有部分样本值【zhí】超【chāo】过标准【zhǔn】品浓度时，可用样本稀释液将【jiāng】标本【běn】进行【háng】适【shì】当稀释后【hòu】再进【jìn】行实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱中【zhōng】取【qǔ】出的【de】浓缩洗涤【dí】液可能【néng】有【yǒu】结晶，属于【yú】正常现象；放置室温，轻【qīng】摇均匀，待结晶溶解后再配置洗涤【dí】液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀【xī】释配【pèi】置成400ml工【gōng】作浓度【dù】的【de】洗涤液【yè】，未用完的放回【huí】4℃

3. 20×洗涤缓冲【chōng】液的稀释：蒸馏水按1：20稀释【shì】，即【jí】1份【fèn】20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠组织【zhī】金属蛋白酶抑制因【yīn】子【zǐ】2(TIMP-2) 捕获【huò】抗体【tǐ】的包被微孔中，依次加入标【biāo】本、标准品、HRP标记的检测【cè】抗体，经过温育【yù】洗涤。用底物TMB显色【sè】，TMB在【zài】过氧化物酶的催化下转化【huà】成蓝色，并在【zài】酸的作用下转【zhuǎn】黄色。颜【yán】色【sè】的深【shēn】浅和样品中的大鼠组【zǔ】织金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2) 呈【chéng】正相关。用酶标【biāo】仪【yí】在【zài】450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计【jì】算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过【guò】夜，然【rán】后1000×g离【lí】心20 分钟，取上清即【jí】可，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避【bì】免反【fǎn】复冻融【róng】。

2. 血浆：用EDTA或肝【gān】素作为抗凝剂采集标本，并将标【biāo】本在【zài】采【cǎi】集【jí】后的30分【fèn】钟内于9-21℃ 1000×g离心【xīn】15分【fèn】钟，取上清即可检测，或将上清【qīng】置于-20℃或【huò】-80℃保存【cún】，但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组【zǔ】织【zhī】，去除残留【liú】血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量【liàng】结果），称重后将组织剪【jiǎn】碎。将【jiāng】剪碎的组织与对应体积的【de】PBS（一般按【àn】1:9的【de】重【chóng】量体积比【bǐ】，比如1g的组织样品对应9mL的【de】PBS，具体体【tǐ】积可根据实验需要适当调【diào】整，并做好【hǎo】记【jì】录。推荐在PBS中【zhōng】加入蛋白酶抑制剂）加入【rù】玻璃匀【yún】浆器中，于冰【bīng】上【shàng】充分研【yán】磨。为了进一步裂解组织细胞【bāo】，可以对【duì】匀浆【jiāng】液进行超声破碎，或反复冻【dòng】融。将匀浆液于5000×g离【lí】心5~10分钟，取【qǔ】上清检【jiǎn】测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟【zhōng】，取上清即可检测，或将【jiāng】上清【qīng】置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避免反复冻融【róng】。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测【cè】的可保存【cún】于4℃，若不【bú】能及时【shí】检测，请按一次使用量【liàng】分装，冻存【cún】于-20℃（1个月内检测【cè】），或-80℃（6个月内检【jiǎn】测），避免【miǎn】反复冻融，标本溶血会影响【xiǎng】检测【cè】结果【guǒ】，因【yīn】此溶血标本不宜【yí】进【jìn】行此项检测。

注意事项：

1. 严格按照规定的时间和温【wēn】度进【jìn】行温育以保证准确结果。所【suǒ】有【yǒu】试剂【jì】都必【bì】须在使用前【qián】达到室【shì】温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板【bǎn】不正确可以导【dǎo】致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温【wēn】育过程【chéng】中【zhōng】不要让微孔干【gàn】燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任【rèn】何反应【yīng】试剂【jì】不能接触漂白溶剂或漂白【bái】溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成【chéng】分都会破坏试【shì】剂【jì】盒【hé】中反应试剂的【de】生物活【huó】性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可【kě】能传播【bō】疾病，所有【yǒu】的样品都应管理好【hǎo】，按照规定的程序处理样品和【hé】检测【cè】装置。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝【lǚ】箔袋中取出【chū】所需【xū】板条，剩【shèng】余【yú】板条用【yòng】自封【fēng】袋密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本【běn】孔，标准品孔各加不【bú】同浓度【dù】的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空白孔【kǒng】外，标准品孔和样本孔中【zhōng】每孔加入【rù】辣根过氧化物【wù】酶（HRP）标【biāo】记【jì】的【de】检测抗体100μL，用封板膜封【fēng】住【zhù】反【fǎn】应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5．弃去液【yè】体，吸水纸上拍干，每【měi】孔加满洗【xǐ】涤液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗【xǐ】板5次（也可【kě】用洗【xǐ】板机【jī】洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液50μL，15min内【nèi】，在450nm波长处【chù】测定各孔【kǒng】的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作【zuò】表中，以标准品浓度作【zuò】横坐标【biāo】，对应OD值作【zuò】纵【zòng】坐标，绘制出【chū】标准品线性回归曲【qǔ】线【xiàn】，按曲线方程计算各样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交叉感【gǎn】染，配置不【bú】同浓度标准品、上样、加不【bú】同【tóng】试【shì】剂都需【xū】要更换【huàn】枪头【tóu】。另外不同试【shì】剂请分别使用不同的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混【hún】合后的显【xiǎn】色【sè】底物在上板前【qián】应为无色，请避【bì】光保存；假如微孔板后，将【jiāng】由物色变成不同深度【dù】的蓝色【sè】。

5. 终止液【yè】上【shàng】板【bǎn】顺序应同显【xiǎn】色【sè】底【dǐ】物上【shàng】板顺【shùn】序一致；加入终止液后，孔内颜色由蓝变【biàn】黄；若孔内有绿色，则表明孔【kǒng】内液体未混匀；请充分混合【hé】。

说明：

1. 由于现有【yǒu】条件及【jí】科【kē】学技术水平尚不【bú】能对所【suǒ】有供货商提供的所【suǒ】有原料进行全面的【de】鉴定与分析，本产品可【kě】能存在一定【dìng】的质量技术【shù】风险。

2. 实验结果与试剂的有效【xiào】性、实验【yàn】者的相关操【cāo】作以及当时的实验【yàn】环境密【mì】切相关，请务必【bì】准【zhǔn】备【bèi】充足【zú】的标本备份。

3. 不同批次的【de】同【tóng】一产品可【kě】能会【huì】有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时【shí】间等，请依据试剂盒内说明【míng】书【shū】进行【háng】实验【yàn】操作，网站电子【zǐ】版【bǎn】说明书仅作参考【kǎo】。

4. 只有全部使用本试剂盒【hé】配【pèi】套【tào】试剂才能保证检测效果，不能混用其【qí】他制造商的【de】产品。只有严【yán】格遵守本试【shì】剂【jì】盒的实验【yàn】说【shuō】明才会得到检测【cè】结果。