本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于体外定量检测【cè】血清【qīng】、血浆【jiāng】、组织匀【yún】浆及相关液体样【yàng】本【běn】中大鼠Ⅱ型前胶原羧基端原肽(PIICP)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过【guò】大量正【zhèng】常标本检验，标本的【de】正常浓度值均在试【shì】剂盒提供的检测范围内，实【shí】验过程中直接取【qǔ】50μL样本上【shàng】样即可。当有部分样本值超过标准【zhǔn】品浓【nóng】度时，可用样本稀释【shì】液将标【biāo】本进行适当【dāng】稀释后【hòu】再【zài】进行实验【yàn】。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从【cóng】冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结【jié】晶【jīng】，属于【yú】正常现象；放置室【shì】温，轻【qīng】摇均匀【yún】，待【dài】结晶溶解后再配置洗涤【dí】液。可将20ml浓缩【suō】洗涤液用蒸【zhēng】馏水或去离子水【shuǐ】稀释【shì】配置成400ml工【gōng】作浓度的洗【xǐ】涤液，未【wèi】用完的放回4℃

3. 20×洗涤缓冲液的稀释【shì】：蒸【zhēng】馏水【shuǐ】按【àn】1：20稀释，即1份20×洗涤缓【huǎn】冲液加19份蒸馏水【shuǐ】。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠【shǔ】Ⅱ型前胶原羧基端原肽(PIICP)捕【bǔ】获抗体的包【bāo】被【bèi】微孔中，依次加入标本【běn】、标准品、HRP标记【jì】的检测【cè】抗体，经【jīng】过温【wēn】育洗涤。用【yòng】底【dǐ】物TMB显色，TMB在过【guò】氧【yǎng】化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用【yòng】下【xià】转化成黄色。颜色的深浅和样品中的大【dà】鼠Ⅱ型【xíng】前【qián】胶原羧基端【duān】原肽(PIICP)呈正【zhèng】相关。用酶标仪在【zài】450nm 波长下测定吸光度【dù】（OD 值），计算样品【pǐn】浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或【huò】4℃过【guò】夜，然后1000×g离【lí】心20 分钟，取【qǔ】上清即可，或将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将【jiāng】标本在【zài】采集后的30分钟内于【yú】9-21℃ 1000×g离心15分钟【zhōng】，取【qǔ】上清即可【kě】检测【cè】，或【huò】将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但应避免【miǎn】反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲【chōng】洗组织，去除残留血液【yè】（匀浆中裂【liè】解的【de】红【hóng】细【xì】胞会影响【xiǎng】测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应【yīng】体积【jī】的PBS（一【yī】般按1:9的重量体【tǐ】积比，比如1g的组织样品对应9mL的【de】PBS，具体体【tǐ】积可【kě】根据实【shí】验需要适当调整，并做【zuò】好记录。推荐在【zài】PBS中加入【rù】蛋【dàn】白酶抑制剂）加入玻【bō】璃匀浆【jiāng】器中，于【yú】冰上充分研【yán】磨。为了进一步【bù】裂解【jiě】组织细胞，可以对匀浆液【yè】进行超声破碎，或反【fǎn】复冻融【róng】。将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分【fèn】钟，取上【shàng】清即可【kě】检【jiǎn】测，或将上清置于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内【nèi】进行检测【cè】的可保存于4℃，若不能【néng】及时检测，请【qǐng】按一次使用【yòng】量分装【zhuāng】，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内【nèi】检测），避免【miǎn】反复冻融，标本溶血会【huì】影响检测【cè】结果，因【yīn】此溶血标本不宜进行此【cǐ】项【xiàng】检【jiǎn】测。

注意事项：

1. 严格【gé】按照规【guī】定的时间和温度【dù】进行温育以【yǐ】保证准确结果【guǒ】。所有试剂都必须在使用【yòng】前【qián】达到室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致【zhì】不准确的【de】结果。在【zài】加入底物前确【què】保尽量【liàng】吸【xī】干孔内液体。温育【yù】过程中不要让微孔【kǒng】干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不【bú】能接触漂白溶剂【jì】或漂白溶【róng】剂所【suǒ】散发的强【qiáng】烈气体。任【rèn】何漂白成分都会【huì】破坏【huài】试剂盒中反应试剂的生【shēng】物活【huó】性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播【bō】疾病，所有【yǒu】的样【yàng】品都应【yīng】管理好，按照规定【dìng】的程序处理样品和【hé】检【jiǎn】测装置。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后【hòu】的铝箔【bó】袋中取出所需板条，剩【shèng】余板【bǎn】条用自封袋密封放【fàng】回【huí】4℃。

2．设置标准品孔和样【yàng】本孔，标【biāo】准品孔各加【jiā】不同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准【zhǔn】品孔和样本孔中每孔加入辣根【gēn】过氧化物酶（HRP）标记的检测抗【kàng】体【tǐ】100μL，用【yòng】封板【bǎn】膜封住反【fǎn】应孔，37℃水浴锅或【huò】恒【héng】温箱温育60min。

5．弃去液体【tǐ】，吸水纸上拍【pāi】干，每孔【kǒng】加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤【dí】液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次【cì】（也可用洗【xǐ】板机洗【xǐ】板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加入终止液50μL，15min内【nèi】，在450nm波长处测定【dìng】各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以【yǐ】标准品【pǐn】浓度作横坐标【biāo】，对【duì】应OD值作纵坐标，绘制【zhì】出标准品线【xiàn】性回归曲线，按曲线方程计算各【gè】样本浓度【dù】值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避【bì】免【miǎn】交叉感【gǎn】染，配置不同浓度标准品、上样【yàng】、加不同【tóng】试剂都需要【yào】更换枪头。另外【wài】不同试【shì】剂请分别使用不【bú】同的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混【hún】合后的显色底【dǐ】物在上【shàng】板前【qián】应为无【wú】色，请避【bì】光保存；假如微【wēi】孔板后，将由【yóu】物色变成不同深度的蓝色。

5. 终止【zhǐ】液上【shàng】板【bǎn】顺序应同显色底【dǐ】物【wù】上板顺序一致；加入终【zhōng】止液【yè】后，孔内颜色由蓝变黄；若孔【kǒng】内有绿色，则表明孔内液体未混【hún】匀；请充分混合。

说明：

1. 由于现【xiàn】有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提【tí】供的所有原【yuán】料进行【háng】全面的鉴定与分【fèn】析【xī】，本产品可能存【cún】在一定的【de】质量技【jì】术风险【xiǎn】。

2. 实验结【jié】果【guǒ】与试剂的有【yǒu】效性【xìng】、实验者【zhě】的相关操作以及【jí】当时的实验环境密【mì】切【qiē】相关，请务必准备充【chōng】足的标本备份。

3. 不同批次的同一产【chǎn】品可能会【huì】有【yǒu】少许差别，如：检测限、灵【líng】敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书【shū】进行实【shí】验【yàn】操作，网站【zhàn】电【diàn】子版说明【míng】书【shū】仅作【zuò】参考。

4. 只有全部使用【yòng】本【běn】试剂盒配套试剂才能保【bǎo】证检测效【xiào】果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试【shì】剂盒的实验【yàn】说明才会得到【dào】检测【cè】结【jié】果。