生物材料准备

    生物材【cái】料冻存前进行的准备工作可能【néng】会对冻存【cún】结果产【chǎn】生影响。对于非复【fù】制性材料，如组织，核酸和蛋【dàn】白等，准备过程包括确【què】认生物材【cái】料处于合适【shì】的溶液或冻存培【péi】养【yǎng】基中，此步【bù】骤的目【mù】的在于复苏时【shí】达到【dào】zui大化的预期用【yòng】途。然而【ér】，活细胞和微生物的稳定性【xìng】及复苏活力【lì】受生长条件和【hé】冻存【cún】前准备【bèi】工作的【de】影响。

    细胞【bāo】冻存前需考【kǎo】虑多种【zhǒng】因素，包括【kuò】细胞类【lèi】型、活力【lì】、生长条【tiáo】件、生【shēng】理状态、数目以及细【xì】胞【bāo】前处理等【děng】。当建立一个新分离株【zhū】或细胞系的初次种子储备【bèi】时，必【bì】须对培【péi】养物进行检测并消毒，确保【bǎo】微生物污染的zui小【xiǎo】化。每次【cì】准备工作后，以及每次准备【bèi】新批次的培养物时【shí】，均要重【chóng】复【fù】这个步骤。

微生物

    生长【zhǎng】于通气培养【yǎng】条件下的微【wēi】生【shēng】物细胞，特【tè】别【bié】是细菌【jun1】和酵【jiào】母，表现【xiàn】出比生长于非【fēi】通气条件下的细【xì】胞【bāo】更强的耐受【shòu】冷却和冻【dòng】存伤【shāng】害 的【de】能【néng】力。T.Nei 认为【wéi】，在通【tōng】气培养【yǎng】条件下，细胞通透性【xìng】更好【hǎo】，且开放条件【jiàn】下培养细胞在冷却过【guò】程中比非通气条件下培养的【de】细胞失水更快。另外，针【zhēn】对微生物细【xì】胞，在对数【shù】生长期后期及稳【wěn】定期早期获得【dé】的细胞表【biǎo】现出更强的冰冻耐受性。从生长后期和静态培养早期收【shōu】集的【de】微生物细胞比生长早期和生【shēng】长晚期的细胞表现【xiàn】了更强的冰冻耐受性。

    一般来讲，初始【shǐ】冻存【cún】的细胞数【shù】目【mù】越多，复苏率越高【gāo】。对【duì】于大多数细菌和酵母而言，保【bǎo】证约 107/ml 的细胞数才能确保足【zú】够数量【liàng】的细胞【bāo】复苏【sū】。由【yóu】于这些细【xì】胞可【kě】便捷地从琼脂【zhī】培养板或斜面上收集，如果需要更大量的【de】细【xì】胞，也可使细胞生长于【yú】液体培养基中通过离【lí】心收集，在【zài】任【rèn】何一【yī】种情【qíng】况【kuàng】下，细胞通常悬浮在包含【hán】冻存【cún】保护剂的新鲜【xiān】培【péi】养基中。原生生物可以通【tōng】过离心浓缩【suō】，但【dàn】通常需要悬浮【fú】于使用的培养基【jī】中，之后使用等【děng】体积含冻存保护剂的新鲜培养基稀释。

    针对芽【yá】孢菌冻存，需要收集【jí】芽【yá】孢【bāo】并重悬于含【hán】冻存保护【hù】剂的【de】新鲜培养基中【zhōng】。冻存前，必【bì】须缩短操【cāo】作时间且确保芽孢并【bìng】未萌发。针【zhēn】对非芽孢菌冻存，冻存前需采用特殊【shū】程序收集菌丝体【tǐ】。某【mǒu】些【xiē】具硬菌【jun1】丝体【tǐ】的真菌，需将含有菌丝体的琼脂块【kuài】从培养基中切出，并将其置于含冻存保护剂的新鲜培养基中【zhōng】。硬【yìng】菌丝【sī】体无法与琼脂培养基很好粘附，生长于肉汤培养基中【zhōng】时，冻【dòng】存前需将【jiāng】菌【jun1】丝体团进【jìn】行混合。

    冻存材料的活力和【hé】复苏率由冻【dòng】存前后的【de】培养和【hé】生长状态决定。活【huó】力是衡量培养【yǎng】物生长和繁殖的一项指标【biāo】。例如原生【shēng】生物材料等某些材料【liào】，需经过多【duō】次传代才能保证其稳定性。复苏细胞数量的估算有【yǒu】多种方法【fǎ】，包括【kuò】连续稀释，平板计数或【huò】直接细【xì】胞计数。通过对比冻存前和复【fù】苏【sū】后细胞【bāo】数量的差【chà】异，可说明细胞复【fù】苏程度【dù】 或冻存过【guò】程是否成功【gōng】。